Data/hora: 09/06/2024 02:45:20

Provedor de dados: 	20	
País: 	Belgium	
Título: 	Aislamiento, clonaje y caracterización biológica del ADN  complementario de la Hormona Hiperglucemiante de Crustáceos de  Litopenaeus schmitti (Decapoda: Penaeidae)	
Autores: 	Yuliet Morera Darias.	
Data: 	2014-07-03	
Ano: 	2009	
Palavras-chave: 	Marine shrimp culture; Anatomical structures; Functional analysis.	
Resumo: 	El desarrollo alcanzado en la camaronicultura hasta el presente exige estudios cada vez más  novedosos en vista a enfrentar nuevos retos. En este sentido resulta necesario el conocimiento de  la estructura-función de los neuropéptidos de la familia de la Hormona Hiperglucemiante de  Crustáceos (familia HHC). Ella  juega un importante papel en el metabolismo y la fisiología  influyendo directamente sobre la muda, el crecimiento, la reproducción, el metabolismo de la  glucosa y lípidos, entre otras. La Hormona Hiperglucemiante de Crustáceos (HHC) es el  componente mayoritario de la familia HHC y el único neuropéptido aislado y secuenciado hasta  el presente. Ella es una hormona pleiotrópica y su función principal es regular el nivel de glucosa  en la hemolinfa. La purificación de los neuropéptidos a partir de su fuente natural de expresión  requiere de cientos de pedúnculos oculares de camarón. Mientras que la obtención del ADN  complementario (ADNc) que codifica para la HHC de pedúnculo ocular es una alternativa para  obtener la HHC en cantidades suficientes y biológicamente activa para posteriores estudios  biológicos en camarones peneidos. En este trabajo, conociendo la secuencia aminoacídica de la  HHC de Litopenaeus schmitti, se diseñaron oligonucleótidos degenerados capaces de aislar el  ADNc de la HHC en camarones peneidos. Como resultado se obtuvo por primera vez el ADNc  de 216 pares de bases que codifica para la región madura de la HHC de L. schmitti. Los análisis  de secuencia del fragmento amplificado por TR-RCP revelaron una alta homología con otras  HHC en camarones peneidos. El análisis de la expresión tejido-específica de la HHC por  Northern blot, mostró que el ARN mensajero (ARNm) de la HHC está presente en el pedúnculo  ocular pero no se encuentra en músculo y estómago. Sin embargo, el análisis semicuantitativo de  TR-RCP reveló su presencia en los tres tejidos. Para contar con suficiente cantidad de la HHC  biológicamente activa, en este trabajo se clonó el ADNc (216pb) de la HHC de L. schmitti en el  vector de expresión pTYB2. Como resultado se obtuvo la HHC recombinante expresada en E.  coli como proteína de fusión a la inteina y formando parte de los cuerpos de inclusión. La  purificación de la proteína de fusión se realizó por el método de electroelusión. La HHC  recombinante mostró capacidad para incrementar el nivel de glucosa en la hemolinfa in vivo en Litopenaeus vannamei. Los animales con ablación bilateral del pedúnculo ocular inyectados con  la HHC recombinante mostraron una actividad hiperglicémica semejante a la mostrada por el  grupo control positivo (animales sin ablación inyectados con PBS). Mientras que, se observaron  diferencias significativas en la concentración de glucosa respecto a los grupos control negativo  que consistieron en animales con ablación bilateral del pedúnculo ocular inyectados con la  proteína inteina (p&lt;0.05) o PBS (p&lt;0.05). Por otra parte, en nuestro trabajo nos propusimos  comprobar la funcionalidad del novedoso mecanismo del ARNi en camarón in vivo, por primera  vez, pues constituye el primer paso para determinar la función de genes desconocidos. Para ello  se sintetizó un ARN doble cadena (ARNdc) a partir del ADNc de la HHC de L. schmitti. Su  capacidad para silenciar la expresión del gen de la HHC se determinó por análisis de su función  biológica principal y del transcrito de la HHC. Se constató la disminución del nivel de glucosa  en la hemolinfa respecto a los grupos controles negativos tratados con un ARNdc no relacionado  (p&lt;0.05) y solución salina (p&lt;0.05). Los resultados de Northern blot y RT-PCR semicuantitativo  mostraron el silenciamiento del ARNm de la HHC 24 horas post-inyección solamente en el  grupo tratado con ARNdc de la HHC. Los resultados obtenidos son el comienzo de los estudios  básicos de los neuropéptidos de la familia HHC. La completa caracterización de todos sus  miembros será una importante herramienta para la manipulación controlada de la reproducción  en camarones peneidos.	
Tipo: 	Theses and Dissertations	
Idioma: 	Espanhol	
Identificador: 	http://hdl.handle.net/1834/5528	
Relação: 	Penaeus monodon: identification and functional characterisation of Dicer-1.  Fish Shell  Immunol 24(2): 223-33.  Suárez O, Ramos L, Martinez L y Huberman A (1996). Morfología del pedúnculo ocular en  los camarones P. schmitti y P. notialis. Rev. Invest. Mar. 17: 143-151.  Sun PS (1994). Molecular cloning and sequence analysis of a cDNA encoding a molt- inhibiting hormone-like neuropeptide from the white shrimp Penaeus vannamei. Mol Mar  Biol Biotechnol 3: 1-6.  Takeuchi K (2000). Cloning of Tilapia actin cDNAs. Published Only in DataBase In press.  Thompson JD, Plewniak F, Thierry J y Poch O (2000). DbClustal: rapid and reliable global  multiple alignments of protein sequences detected by database searches. Nucleic Acids Res  15: 2919-26.  Tirasophon W, Roshorm Y, Panyim S (2005). Silencing of yellow head virus replication in  penaeid shrimp cells by dsRNA. Biochem Biophys Res Commun 334(1): 102-7.  Tiu SH y Chan SM (2007). The use of recombinant protein and RNA interference  approaches to study the reproductive functions of a gonad-stimulating hormone from the  shrimp Metapenaeus ensis. Febs J 274: 4385-4395. Toullec JY, Serrano L, Lopez P, Soyez D y Spanings-Pierrot C (2006). The crustacean  hyperglycemic hormones from an euryhaline crab Pachygrapsus marmoratus and a fresh  water crab Potamon ibericum: eyestalk and pericardial isoforms. Peptides 27(6): 1269-80.  Treerattrakool S, Eurwilaichitr L, Udomkit A y Panyim S (2002). Secretion of Pem-CMG,  a peptide in the CHH/MIH/GIH family of Penaeus monodon, in Pichia pastoris is directed  by secretion signal of the alpha-mating factor from Saccharomyces cerevisiae. J Biochem  Mol Biol 35: 476-481.  Treerattrakool S, Panyim S, Chan SM, Withyachumnarnkul B y Udomkit A (2008).  Molecular characterization of gonad-inhibiting hormone of  Penaeus monodon and  elucidation of its inhibitory role in vitellogenin expression by RNA interference. Febs J  275(5): 970-80.  Treerattrakool S, Udomkit A, Eurwilaichitr L, Sonthayanon B y Panyim S (2003).  Expression of biologically active crustacean hyperglycemic hormone (CHH) of Penaeus  monodon in Pichia pastoris. Mar Biotechnol (NY) 5: 373-379. Ulvila J, Parikka M, Kleino A, Sormunen R, Ezekowitz RA, Kocks C y Ramet M (2006).  Double-stranded RNA is internalized by scavenger receptor-mediated endocytosis in  Drosophila S2 cells. J Biol Chem 281(20): 14370-5.  Udomkit A, Treerattrakool S y Panyim S (2004). Crustacean hyperglycemic hormones of  Penaeus monodon: cloning, production of active recombinant hormones and their  expression in various shrimp tissues. J Exp Mar Biol Ecol 298: 79-91.  Udomkit A, Chooluck S, Sonthayanon B y Panyim S (2000). Molecular cloning of a cDNA  encoding a member of CHH/ MIH/ GIH family from Penaeus monodon and analysis of its  gene structure. J Exp Mar Biol Ecol 244: 145- 156.  Vallejo LF y Rinas U (2004). Strategies for the recovery of active proteins through  refolding of bacterial inclusion body proteins. Microbial Cell Factories 3(11).  Van Wormhoudt A y Ceccaldi HJ (1973). Activity of digestive enzymes during  vitellogenesis in Palaemon serratus. C R Seances Soc Biol Fil 167: 679-683.  Van Wormhoudt A, Bellon C y Le Roux A (1978). Effect of endocrine formations on the  incorporation of tritiated leucine into proteins of the  hepatopancreas of the shrimp  Palaemon serratus Pennant. Gen Comp Endocrinol 35: 263-273.  Wang WH, McNatt LG, Shepard AR, Jacobson N, Nishimura DY, Stone EM, Sheffield VC  y Clark AF (2001). Optimal procedure for extracting RNA from human ocular tissues and  expression profiling of the congenital glaucoma gene FOXC1 using quantitative RT-PCR.  Mol vision 7: 89-94. Webster SG, Dircksen H y Chung JS (2000). Endocrine cells in the gut of the shore crab  Carcinus maenas immunoreactive to crustacean hyperglycaemic hormone and its precursor- related peptide. Cell Tissue Res 300: 193-205.  Westenberg M, Heinhuis B, Zuidema D y Vlak JM (2005). siRNA injection induces  sequence-independent protection in Penaeus monodon against white spot syndrome virus.  Virus Res 114(1-2): 133-9.  Xu J, Han F y Zhang X (2007). Silencing shrimp white spot syndrome virus (WSSV) genes  by siRNA. Antiviral Res 73: 126-131.  Yao Y, Zhou K-Y y Song D-X (2006). Expression and policlonal antibody preparation of  molt- inhibiting hormone 1 (MIH1) from the mitten crab Eriocheir japonica sinensis. Acta  Zool Sin 52: 209- 214. Yodmuang S, Tirasophon W, Roshorm Y, Chinnirunvong W y Panyim S (2006) YHV- protease dsRNA inhibits YHV replication in  Penaeus monodon  and prevents mortality.  Biochem Biophys Res Commun 341(2): 351-6.  Zamore PD, Tuschl T, Sharp PA y Bartel DP (2000). RNAi: double-stranded RNA directs  the ATP-dependent cleavage of mRNA at 21 to 23 nucleotide intervals. Cell 101  Zarubin TP, Chang ES y Mykles DL (2008). Expression of recombinant eyestalk crustacean  hyperglycemic hormone from the tropical land crab, Gecarcinus lateralis, that inhibits Y- organ ecdysteroidogenesis in vitro. Mol Biol Rep.  Zheng Y, Roy PJ, Liang P y MacRae TH (1998). Cloning and sequencing of an alpha- tubulin cDNA from  Artemia franciscana: evidence for translational regulation of alpha- tubulin synthesis. Biochim Biophys Acta 1442(2-3): 419-26.	
Formato: 	98	
Fonte: 	http://creativecommons.org/licenses/by-nc/3.0/