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This report presents a new method for detection and confirmed quantification of dinophysistoxins (DTXs) using high-performance liquid chromatography coupled to mass spectrometry with an ion trap and électrospray interface (HPLC/ESI/MS2). The parameters of the ESI source and ion trap spectrum analyser were optimised to provide detection of DTXs with maximum sensitivity. These improvements were obtained after reverse-phase separation on a C18 column, with a first elution to 0.1% TFA (75:25, v/v) in isocratic acetonitrile/water mode without flow split at a column flow rate of 200 µl/min for 15 min. A second elution gradient step was added to allow optimised processing of long series of analyses without signal obstruction. This method was validated (specificity, detection and quantitation limits, linearity, accuracy) on two different matrices: mussel digestive glands analysed after a classical liquid/liquid extraction procedure and natural phytoplankton analysed after extraction in solid phase on silica cartridges. In comparison with HPLC by spectrofluorescence detection (HPLC/F), the sensitivity of this method reduced quantification limits from 0.5 to 0.05 injected ng, i.e. allowing detection of 0.011 µg.g-1 okadaic acid (OA) from 4 g of crude mussel digestive gland extract. For a crude phytoplankton extract of Dinophysis spp at 50 cells/litre, 2 pg.cell-1 OA can be detected.
Ce rapport est une présentation d’une nouvelle méthode pour l’identification et la quantification confirmée des dinophysistoxines (DTXs) utilisant la Chromatographie Liquide Haute Performance couplée à la Spectrométrie de Masse à piégeage d’ions via une interface d’électro-nébulisation – ou électrospray - (CLHP/ESI/SM2). Les paramètres de la source ESI et de l’analyseur à piège d’ions ont été optimisés pour fournir une détection des DTXs avec un maximum de sensibilité. Ces améliorations ont été effectuées après une séparation en phase inverse sur une colonne C18 avec une première élution sans diviseur de débit en mode isocratique d’acétonitrile/eau à 0,1 % TFA (75 :25, v/v) à 200 µl/min pendant 15 min. Une deuxième étape d’élution en mode gradient a ensuite été ajoutée, elle permet un traitement optimisé de longues séries d’analyses, sans qu’il en résulte un encombrement du signal. Cette méthode a fait l’objet d’une validation (spécificité, seuil de détection et de quantification, linéarité, exactitude) sur deux matrices différentes : des glandes digestives de moules analysées après une procédure classique d’extraction liquide/liquide et du phytoplancton naturel analysé après extraction en phase solide sur des cartouches de silice. En comparaison avec la CLHP par détection spectrofluorescence (CLHP/F) la sensibilité de cette méthode nous a permis de passer d’un seuil de quantification de 0,5 ng injecté à 0,05 ng ce qui revient à pouvoir détecter à partir de 4 g de glandes digestives de moules une quantité d’acide okadaïque (AO) de 0,011µg.g-1. De même, pour un extrait brut phytoplanctonique à 50 cellules/litre de Dinophysis sp nous avons pu détecter une quantité d’AO de 2 pg.cellule-1.
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